高中生物 聚合酶链式反应 PCR

前言

PCR 技术是一种以 DNA 半保留复制为基本原理，在短时间内对目的基因的碱基序列进行大量扩增的技术。两种引物分别结合在目的基因的两侧，经过二到三轮循环，即可产生目的基因序列。由于它扩增高效、自动化水平高，它被广泛应用于遗传学研究中。

PCR 基本知识

PCR 的前期准备需要以下原料/物质：

1. 缓冲液（含 ，用以激活 DNA 聚合酶）
2. 四种脱氧核苷酸（实际上为四种脱氧核糖核苷三磷酸：dATP dTTP dGTP dCTP，类比 ATP，三磷酸中的高能磷酸键可水解供能）
3. 两种引物
4. 耐高温的 DNA 聚合酶（通常为 TaqDNA 聚合酶，从水生栖热菌中分离得到）
5. DNA 模板链

这里最重要的是引物的设计，引物是一种能与 DNA 双链结合的短单链核酸，长度在 20-30 碱基对。因为 DNA 聚合酶只能从 DNA 片段的 端开始连接脱氧核苷酸，因而就需要人工设计一个片段，让它与 DNA 链结合，从而让聚合酶正常复制出完整的链。

PCR 分为变性、复性（退火）、延伸三步。首先，在 的高温条件下处理 DNA 分子，使双链间的氢键断开；接着将温度重新降至 左右，让预先设计好的两种引物与 DNA 双链分别结合；最后重新升温至 左右，在保证引物不脱离双链的情况下，让耐高温的 DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶）将游离的脱氧核苷酸结合到引物片段的 端（羟基端）并继续结合直到完成双链的复制。如下图：

我们发现，PCR 复性时，引物的结合位点总是更靠近模板链的 端。这是因为 DNA 聚合酶复制时子链的延伸方向是 端。又因为 DNA 双链是反向平行的，因此引物的 端会更接近目的基因的一段，延伸时就可以将目的基因复制出来。如此便是 PCR 的三大基本步骤。

PCR 中的数量关系

我们在必修二中学过，DNA 半保留复制得到子代 DNA 分子的个数是呈指数级增长的（单个 DNA 经 代复制后得到 个 DNA 分子）。这是因为每次 DNA 复制后的产物都可作为下一轮复制的模板。

一般地，如果两个引物均未结合在 DNA 两端，那么至少经过三轮循环，才会产生完整的目的基因。如下图：

我们根据分子两条链的相对长短，将扩增产物分为三类——中长链、短中链和短短链，其中短短链为目的基因。不难发现，中长链只会来源于 DNA 两条模板链，因而总数恒定为 ；多推几个循环可以发现中长链和短中链的总数为 ，那么短中链的总数为 ；减去前两种可得目的基因（短短链）的总数为 。常规 PCR 会进行约 个循环，也就是说在理想情况下，PCR 最终产物将有 为目的基因。

再来看引物，发现除了原 DNA 链以外的链都是由引物扩增而来，因此会消耗共 个引物分子，均分到每种引物就是 条。

那如果有一种引物结合在 DNA 链的端位呢？如下图：

此时仅需经历两轮 PCR 即可得目的基因。如果两种引物均结合在端位，模型退化成 DNA 的半保留复制，实际操作没有意义，故舍去不谈。

反向 PCR 技术

利用质粒构建表达载体后，我们有时并不确定目的基因的插入位点甚至是方向，这种不确定性在仅用同种限制酶切割质粒、以及质粒上存在多个限制酶切位点时特为尤甚。此时我们就需要获得目的基因两侧的碱基序列，就可通过序列比对来快速确定目的基因的具体插入位置。

反向 PCR 主要在环状 DNA 上进行，因为环形 DNA 意味着原本不相连的两段外序列如今连接在一起，那么就可以用 PCR 的方式一次性扩增出该片段。基本思路与普通 PCR 很相似，唯一不同的是，此时外序列变为目的基因，那么设计的引物就应该结合在外序列的 端，即原目的基因的 端。余下的内容就是普通 PCR 的范畴了，如下图：

大引物 PCR 技术

在蛋白质工程中，经常涉及到的一个操作是将某种氨基酸对应的 DNA 编码转换成另一种氨基酸的编码。就需要我们在保证其他碱基顺序和种类不变的情况下，定点突变目的位点的若干碱基，此时便可以使用大引物 PCR 来获得定点突变的 DNA。

开始前，我们需要准备常规上下游引物，它们将分别结合在 DNA 模板链的端位，以及一个在对应位点有过修改的突变引物。首先让上游引物与突变引物结合，进行普通 PCR，有了突变位点的影响，最终扩增出的目的基因在指定位点是有目标突变的。但是产物并非是全部的 DNA 序列（短短链），我们还需要再进行一轮 PCR，用到下游引物和突变引物，即可扩增出完整的定点突变基因。基本思路如下图：